Roche BenchMark ULTRA Interpretation Guide

Značka: Roche

Model: BenchMark ULTRA

Typ: Interpretation Guide

Táto príručka je tiež vhodná pre

BenchMark XT/LT

Průvodce interpretací VENTANA MMR

RxDx Panel pro karcinom endometria

(EC)

VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

Obsah

Úvod 1

Určené použití 3

Určené použití výrobku 3

Účel průvodce interpretací 3

Klinické hodnocení 4

Charakteristiky barvení 4

Kritéria přijatelnosti morfologie a pozadí 5

Případová kritéria pro klinické hodnocení 5

Hodnoticí algoritmus 6

Kontroly 8

Vnitřní pozitivní kontroly 8

Pracovní postup pro vzorky 10

Referenční snímky 12

Proﬁcientní případy 12

Deﬁcientní případy 14

Nejasné případy 18

Dopad preanalytických podmínek na panel VENTANA MMR RxDx Panel 28

Přijatelné podmínky ﬁxace k dosažení optimálních výsledků barvení 28

Stabilita sklíček s řezy 32

Tloušťka tkáně 32

Literatura 33

Oprava neshod DNA (MMR) je konzervovaný molekulární

mechanismus, jehož funkcí je oprava nesprávných substitucí

bází, k nimž spontánně dochází během replikace DNA. Metody

založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) ukázaly,

že selhání mechanismu MMR často vede k mikrosatelitové

nestabilitě (MSI), což je stav, kdy jsou do DNA vloženy krátké

tandemové repetice nukleotidů.– Když je počet repetic roven

30% analyzovaných mikrosatelitových lokusů nebo větší, lze MSI

dále charakterizovat jako MSI-High (MSI-H). Defekty v MMR

aparátu byly přičítány mutacím v MMR proteinech, nejčastěji

MLH1, PMS2, MSH2 a MSH6.

Proteiny MLH1 a PMS2 běžně fungují společně v heterodimerním

komplexu, stejně jako proteiny MSH2 a MSH6. Když MMR

funguje běžným způsobem, heterodimer MSH6/MSH2 se váže

na neodpovídající DNA. Tato vazba indukuje konformační

změnu, díky níž se heterodimer MLH1/PMS2 může vázat na

komplex MSH6/MSH2 navázaný na DNA, což vede k excizní

opravě postižené DNA. Mutace v těchto proteinech nebo

jejich nedostatky vedou k časté MSI a somatické mutaci v

důsledku chyby replikace. Ukázalo se, že testování MMR pomocí

imunohistochemie (IHC) je užitečné při identiﬁkaci genů MMR,

které pravděpodobně obsahují zárodečnou linii nebo somatické

změny.

Tradičně byly léčebné postupy u onkologických pacientů

diktovány speciﬁckou malignitou. Nově se objevující

imunoterapie, zejména ty, které modiﬁkují buněčné dráhy

zahrnující proteiny programované buněčné smrti 1 (PD-1) nebo

proteiny programované buněčné smrti ligandu 1 (PD-L1), však

terapeutické strategie lékařů přetvářejí. PD-1 je inhibiční receptor

exprimovaný na T-buňkách po aktivaci T-buněk, který je udržován

ve stavech chronické stimulace, jako je chronická infekce nebo

rakovina. Exprese PD-L1 byla pozorována v imunitních buňkách

a maligních buňkách a bylo uvedeno, že aberantní exprese PD-L1

na nádorových buňkách (TC) brání protinádorové imunitě, což

vede k úniku imunitní odpovědi. Přerušení dráhy PD-L1/PD-1

představuje tedy zajímavou strategii pro znovuoživení nádorově

speciﬁcké imunity T-buněk.

MMR proteiny (MLH1, PMS2, MSH2 a MSH6) jsou všudypřítomně

exprimovány v proliferujících běžných i maligních buňkách.

Mnoho běžných druhů rakoviny je MMR deﬁcientních (dMMR)

a vykazuje MSI. Několik studií prokázalo, že deﬁcience MMR

koreluje s vyšší expresí proteinů PD-1 nebo PD-L1.– MMR

proteiny tedy mohou být užitečné jako prediktivní biomarkery pro

terapii cílenou na PD-1; konkrétně může ztráta exprese jednoho

nebo více MMR proteinů predikovat vyšší pravděpodobnost

odpovědi na takovou terapii.– Inhibitory PD-1 mohou být

prospěšné u mnoha běžných druhů rakoviny s vysokou frekvencí

deﬁcience MMR a/nebo MSI-H bez ohledu na tkáň původu

rakoviny. Pacienti, kteří uvažují o cílené terapii PD-1, proto

budou mít prospěch z doprovodného diagnostického testu k

identiﬁkaci populace pacientů s deﬁciencí MMR.

Karcinom endometria (EC) je jednou z nejčastějších

gynekologických malignit.

Často u něj bylo zaznamenáno mnoho

genetických změn, včetně MSI.

Rovněž bylo nadneseno, že

MSI EC může zvýšit expresi proteinu PD-L1 ve srovnání s EC s

mikrosatelitovou stabilitou (MSS).

Zatímco léčba EC se liší v

závislosti na stupni, histologii a stadiu onemocnění,

je hodnocení

stavu MMR u nádorů EC užitečné pro stanovení prognózy a vedení

léčby.

Pacienti, kteří zvažují terapii cílenou na PD-1, proto budou

mít prospěch z doprovodného diagnostického testu k identiﬁkaci

stavu MMR.

Ztráta exprese kteréhokoli ze základních MMR proteinů, včetně

MLH1, PMS2, MSH2 nebo MSH6, způsobuje deﬁcienci MMR.

Přítomnost barvení pro všechny čtyři markery MMR proteinu v

nádoru naznačuje, že případ je z hlediska stavu VENTANA MMR

IHC proﬁcientní. Absence barvení v kterémkoli z markerů MMR

proteinu u panelu VENTANA MMR RxDx Panel naznačuje, že

případ je z hlediska stavu VENTANA MMR IHC deﬁcientní.

Úvod

VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria 1

2 VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria

Určené použití

Určené použití výrobku

Podrobné určené použití tohoto výrobku, včetně souvisejících

indikací, naleznete v příslušných příbalových informacích k panelu

VENTANA MMR RxDx Panel.

Účel průvodce interpretací

Cíle tohoto průvodce jsou následující:

• Poskytnout patologům nástroj, jenž jim usnadní klinické

hodnocení řezů nádoru ﬁxovaných formalínem, zalitých

parafínem (FFPE), které jsou barveny panelem VENTANA

MMR RxDx Panel v souladu s navrhovaným označením

výrobku.

• Poskytnout fotograﬁcké snímky, které ilustrují vzory barvení,

jež mohou být výsledkem barvení nádorových tkání pomocí

panelu VENTANA MMR RxDx Panel.

• Poskytnout ukázkové snímky nejasných případů, které mohou

poskytnout vodítko při vyhodnocení.

• Poskytnout vodítko při používání prvků běžné tkáně, pozitivní

na MMR protein, které slouží jako vnitřní pozitivní kontrola při

obarvení panelem VENTANA MMR RxDx Panel.

VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria 3

Stav MMR – intaktní a ztráta: V těchto případech karcinomu endometria vykazují jádra jednoznačné barvení, což je převládající

vzor barvení pozorovaný u většiny nádorových tkání v intaktním stavu MSH6 (levý obraz). Absence jakéhokoli jaderného barvení

v nádorových tkáních představuje stav ztráty MSH6 (pravý obraz). Jednoznačné jaderné barvení v buňkách interní kontroly (tj.

lymfocytech) v blízkosti životaschopných nádorů slouží jako přijatelné vnitřní pozitivní kontroly.

Charakteristiky barvení

Klinické hodnocení

Buňky označené jednotlivými testy na panelu VENTANA MMR

RxDx Panel jsou vyhodnocovány z hlediska přítomnosti nebo

nepřítomnosti signálu diaminobenzidinu (DAB). Barvení panelem

VENTANA MMR RxDx Panel v MMR proteinech probíhá podle

jaderného vzoru. Ztráta kteréhokoli z MMR proteinů detekovaná

panelem VENTANA MMR RxDx Panel je pozorována v jádrech

nádorových buněk. Stav MMR je klasiﬁkován jako intaktní nebo

ztráta pouze na základě jednoznačného jaderného barvení.

• Intaktní stav je charakterizován nádorovými buňkami,

které vykazují jednoznačné barvení o stejné intenzitě, jako je

intenzita vnitřních kontrol nad pozadím, nebo vyšší.

• Stav ztráty je charakterizován nepřítomností jakéhokoli

detekovatelného signálu. Případy ztráty mohou stále vykazovat

světle šedé zbarvení jader.

Signál může být distribuován homogenně, přičemž má jednotnou

úroveň intenzity v neoplastických částech nádoru, nebo může

být distribuován heterogenně, přičemž má více než jednu úroveň

intenzity. To by mělo to být snadno detekovatelné při nízkém

zvětšení, například 2× nebo 4×. Graﬁcké znázornění typů

neoplastických buněk / barvicích prvků označených panelem

VENTANA MMR RxDx Panel je uvedeno v části Referenční

snímky v tomto průvodci interpretací. K vyhodnocení přítomnosti

pozadí v testovaných vzorcích a ke stanovení základní linie

intenzity barvení se používá druhově shodná negativní reagenční

kontrola (NRC). Kritéria přijatelnosti morfologie a pozadí jsou

uvedena v tabulce 1. Případová kritéria pro hodnocení stavu MMR

u neoplastické tkáně kterýmkoli ze čtyř testů v panelu VENTANA

MMR RxDx Panel jsou uvedena v tabulce 2.

Absence jaderného barvení v

nádorových buňkách

Jednoznačné jaderné barvení v

nádorových buňkách

Silné jaderné barvení v

lymfocytech

4 VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria

MSH6 10x MSH6 10x

Kritéria přijatelnosti morfologie a pozadí

U každého případu obarveného panelem VENTANA MMR RxDx Panel se hodnotí přijatelnost morfologie tkání a pozadí s využitím kritérií

popsaných v tabulce 1.

Případová kritéria pro klinické hodnocení

Tabulka 2 shrnuje kritéria pro sklíčko s neoplastickou tkání, které má být hodnoceno z hlediska stavu MMR s jakýmkoli testem v panelu

VENTANA MMR RxDx Panel.

Kritéria Přijatelné Nepřijatelné

Morfologie Analyzované buněčné prvky jsou

vizualizovány, což umožňuje klinickou

interpretaci konkrétního barvení

Analyzované buněčné prvky nejsou vizualizovány,

což ohrožuje klinickou interpretaci konkrétního

barvení

Pozadí Pozadí nenarušuje klinickou interpretaci

speciﬁckého barvení

Pozadí narušuje schopnost interpretovat speciﬁcké

barvení

Tabulka 1: Kritéria přijatelnosti morfologie a pozadí

Klinická interpretace Kritéria vzoru barvení

Hodnotitelné (vše musí být pravda)

1. H&E má ≥50 životaschopných nádorových buněk

2. Sklíčko Negative Reagent Control je přijatelné

3. Morfologie je přijatelná

4. Pozadí je přijatelné

5. Vnitřní pozitivní kontroly mají jednoznačné jaderné barvení

Nehodnotitelné (pokud je jedno z kritérií

v této části pravdivé, mělo by být barvení

sklíčka zopakováno, případně by měl být

případ odmítnut)

1. H&E má <50 životaschopných nádorových buněk

2. Sklíčko Negative Reagent Control je nepřijatelné

3. Morfologie je nepřijatelná

4. Pozadí je nepřijatelné

5. Vnitřní pozitivní kontroly nemají jednoznačné jaderné barvení

6. Interpretace není možná z důvodu ztráty tkáně, absenci nádoru, kvůli

artefaktům a/nebo artefaktům na okrajích

Tabulka 2: Kritéria zhodnotitelnosti – hodnotitelné a nehodnotitelné

VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria 5

VENTANA MMR RxDx Panel obsahuje čtyři testy: VENTANA anti-

MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-

PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA

anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody

a VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary

Antibody. K barvení každou z těchto protilátek je zapotřebí sériový

řez tkáně testovaného vzorku; k barvení hematoxylinem a eosinem

(H&E) a protilátkami NRC odpovídajícími druhům příslušné

protilátky panelu VENTANA MMR RxDx Panel (Negative Control

(Monoclonal) (mNRC) nebo Rabbit Monoclonal Negative Control

Ig (rNRC)) jsou zapotřebí další sériové tkáňové řezy testovaného

vzorku.

Neoplastické buňky obarvené panelem VENTANA MMR

RxDx Panel jsou vyhodnocovány z hlediska přítomnosti nebo

nepřítomnosti signálu DAB. Odpovídající sklíčko obarvené NRC

se používá k posouzení nespeciﬁckého barvení pozadí a stupně

barvení pozadí, jehož výskyt v důsledku speciﬁckých tkáňových

prvků je znám (viz snímky proﬁcientních a deﬁcientních případů).

Pokud hodnocení H&E naznačuje, že pacientský vzorek je

nedostatečný (například pokud je přítomno méně než 50

životaschopných nádorových buněk), měl by se získat nový vzorek.

Opakované barvení vzorku pro konkrétní test MMR RxDx v rámci

panelu (např. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal

Primary Antibody) by se mělo provádět na neobarvených

sklíčkách, pokud (1) sklíčko s případem, obarvené příslušnou

NRC pro daný test, nevykazuje přijatelné barvení, nebo (2) pokud

sklíčko s případem, obarvené tímto konkrétním testem MMR RxDx

(např. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary

Antibody), nelze vyhodnotit. Pokud některé ze sklíček nelze

interpretovat z důvodu nedostatečného zbarvení v buňkách vnitřní

pozitivní kontroly, přítomnosti artefaktů, efektů okrajů, nekrózy,

nedostatku tkáně anebo z jiného důvodu, sklíčko nelze vyhodnotit.

Pokud je barvení kontroly přijatelné a sklíčka obarvená panelem

VENTANA MMR RxDx Panel lze vyhodnotit, mohou být sklíčka

hodnocena vyškoleným patologem, jak je popsáno v hodnoticím

algoritmu.

POZNÁMKA: Soupravy OptiView DAB IHC Detection Kit a

OptiView Ampliﬁcation Kit jsou jedinými reagenciemi pro detekci,

které jsou pro použití s panelem VENTANA MMR RxDx Panel

doporučovány.

Interpretace pro expresi proteinu a stav MMR pro panel

VENTANA MMR RxDx Panel jsou uvedeny níže v tabulkách 3

a 4. Reprezentativní případy jsou popsány v části Referenční

snímky.

Hodnocení panelu VENTANA MMR RxDx Panel:

Hodnoticí algoritmus

Tabulka 4: VENTANA MMR RxDx Panel – interpretace stavu MMR

Proﬁcientní Deﬁcientní

Všechny čtyři proteiny (MLH1, PMS2, MSH2 a MSH6) v

panelu vykazují intaktní expresi.

Alespoň jeden protein (MLH1, PMS2, MSH2 nebo MSH6) v panelu

vykazuje ztrátu exprese.

Tabulka 3: VENTANA MMR RxDx Panel – interpretace exprese proteinu

Intaktní exprese proteinu Ztráta exprese proteinu

Jednoznačné jaderné zbarvení životaschopných

nádorových buněk za přítomnosti přijatelných vnitřních

pozitivních kontrol (např. jaderné barvení v lymfocytech,

ﬁbroblastech nebo normálním epitelu v blízkosti

nádoru).

Jednoznačná ztráta jaderného barvení nebo fokální slabé

nejednoznačné jaderné barvení životaschopných nádorových

buněk za přítomnosti přijatelných vnitřních pozitivních kontrol.

Tečkované jaderné barvení je považováno za negativní.

6 VENTANA MMR RxDx Panel pro karcinom endometria